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图1. 超分子STING水凝胶的设计及个性化TEV/GC-MF疫苗的构建用于癌症免疫治疗。(a) MSA-RGD两亲性分子的化学结构。(b) 个性化TEV/GC-MF疫苗的制备过程及其提出的抗肿瘤免疫治疗机制示意图。

（1）TEV/GC-MF水凝胶疫苗的设计与表征

为构建生物响应性超分子佐剂水凝胶分子，研究团队顺利获得位点特异性偶联设计了MSA-RGD两亲性前药。疏水性STING激动剂MSA-2经3-(吡啶-2-基二硫基)丙-1-醇修饰引入谷胱甘肽（GSH）可切割二硫键，随后与亲水性CVVGRGD肽偶联得到MSA-RGD。质谱证实成功合成。MSA-RGD在水溶液中自组装成丝状结构（MF），TEM清晰显示其形貌。PBS的加入诱导静电屏蔽，触发瞬时溶胶-凝胶转变，倒置瓶实验及流变学分析（G′超过G′′）均证实水凝胶形成。SEM显示水凝胶具有高度多孔且相互连接的架构，为DCs浸润和迁移给予理想物理框架。TEVs经TEM确认为典型囊泡形态，DLS显示粒径主要分布在50–100 nm，Western blot检出阳性标志物Alix和CD63、阴性标志物Gm130缺失，证实成功分离。鉴于TEVs负Zeta电位（−16.07 mV），顺利获得静电作用吸附至正电位MF上，Zeta电位由19.97 mV降至11.7 mV，CLSM证实TEVs在水凝胶网络中均匀分散。包载TEVs和GM-CSF后，复合水凝胶仍保持良好的凝胶化行为。体外释放实验显示，30天内MSA-RGD累积释放约50.72%，GM-CSF约68.33%；在10 mM GSH条件下，二硫键快速断裂，4 h内释放57.93%的MSA-2前药。体内实验表明，MF溶液皮下注射后30 min内形成凝胶，30天仍残留14.91%；与游离TEVs相比，水凝胶组TEVs在注射部位滞留显著延长，第15天仍可检测到强信号，且主要器官荧光微弱，表明水凝胶有效限制TEVs于局部微环境。

图2. TEV/GC-MF水凝胶疫苗的表征。a) MSA-RGD丝状物（MF）的代表性TEM图像，比例尺：200 nm。b) PBS诱导MF溶液发生溶液-水凝胶转变。c) 添加PBS后MF溶液转变为水凝胶的储能模量（G′）和损耗模量（G′′）。d) MF-gel的代表性SEM图像，比例尺：20 μm。e) TEVs的代表性TEM图像，比例尺：100 nm。f) TEV和细胞裂解液中外泌体标志物Alix、CD63和Gm130的Western blot分析。g) MF溶液及负载TEVs和GM-CSF后的Zeta电位，n = 3。h) MF-gel中TEVs分布的共聚焦图像，TEVs用Dil标记。i) 添加PBS后TEV-MF溶液转变为水凝胶的G′和G′′。j) GC/MF-gel中MSA-RGD和GM-CSF的累积释放曲线，n = 3。k) MSA-RGD溶液与10 mM GSH孵育后游离MSA-2的释放曲线，n = 3。l) MF水凝胶的凝胶化与降解图像。m) MF水凝胶降解曲线的定量分析，n = 3。n) 荧光IVIS图像显示以溶液形式注射或负载于MF溶液后的TEVs体内滞留情况，TEVs用DiR标记。o) TEVs滞留曲线的定量分析，n = 3。所有定量数据以平均值±SD表示，*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01，***P ≤ 0.001，****P ≤ 0.0001。

（2）TEV/GC-MF水凝胶疫苗构建原位免疫微环境并时空增强抗原加工与免疫激活

研究团队第一时间验证了TEVs的抗原特性。从B16-OVA细胞分离的TEVs经Western blot证实含有代表性肿瘤相关抗原及新抗原GP100、Trp1和OVA。DC2.4细胞摄取实验显示，Dil标记的TEVs与溶酶体标志物呈时间依赖性共定位，提示其进入溶酶体进行抗原加工。BMDCs体外活化实验表明，MSA-2和MSA-RGD均可诱导DC成熟，而TEV与MSA-RGD联合处理使CD80+/CD86+比例达34.15%，SIINFEKL-H2Kb+ DCs达22.28%，MHC-II表达亦显著上调，证实TEVs在MSA-RGD存在下有效促进DC活化。为验证原位免疫微环境的建立，团队在小鼠模型中评估了疫苗招募和活化DCs的能力。结果显示，GM-CSF的引入显著增加水凝胶中CD11c+ DCs比例（42.23%），远高于对照组（22.63%）；TEV/GC-MF配方显著增加抗原呈递cDC1（XCR1+）亚群，并提高cDC2和单核细胞来源DCs水平。STING通路验证显示，TEV/GC-MF组p-TBK1和p-IRF3表达显著增强，IFN-β分泌升高，证实有效STING激活。该组水凝胶内活化CD80+/CD86+ DCs比例达43%，CCR7+ DCs达31.2%。淋巴结分析进一步显示，TEV/GC-MF组CD80+/86+ DCs、XCR1+ DCs、CCR7+ DCs及抗原特异性SIINFEKL-H2Kb+ DCs均显著增加；CD8+ T细胞比例约37.1%，抗原特异性SIINFEKL+ CD8+ T细胞达7.05%。此外，空间共定位对照实验证实，TEVs与GC-MF凝胶物理分离给药无法达到共包载的免疫增强效果，表明空间共定位对原位免疫微环境的功能至关重要。

图3. TEV/GC-MF水凝胶疫苗构建原位免疫微环境以增强免疫应答。a) TEVs中代表性抗原GP100、Trp1和OVA的Western blot分析；B16-OVA细胞裂解液用作生物学对照。b) 共聚焦显微镜图像显示DC2.4细胞在不同时间点对TEVs的摄取。细胞核用DAPI染色，溶酶体用Lyso-Tracker染色，TEVs用Dil染色。比例尺：20 μm。c) 各处理组CD80+/86+ DCs的定量分析及d) SIINFEKL-H2Kb+ DCs，n = 4。e) 水凝胶中CD11c+ DCs招募的代表性流式细胞术图。f) 各组水凝胶中CD11c+ DCs招募的定量分析，n = 4。g) 各组水凝胶中XCR1+ DCs的定量分析，n = 4。h) 各处理组CD80+/86+ DCs的代表性流式细胞术图及i) 定量分析，n = 4。j) 各组水凝胶中归巢淋巴结的CCR7+ DCs，n = 4。k) 淋巴结免疫分析，各组淋巴结中活化CD80+/86+ DCs、l) XCR1+ DCs、m) CCR7+ DCs及n) 抗原特异性SIINFEKL-H2Kb+ CD11c+ DCs的定量分析，n = 4。o) 免疫后第7天淋巴结中CD8+ T细胞及p) 抗原特异性SIINFEKL四聚体+ CD8+ T细胞的定量分析，n = 4。q) 示意图描绘水凝胶疫苗作为原位免疫微环境，招募DCs、促进其活化、迁移至淋巴结并最终促进肿瘤特异性T细胞增殖。图(q)使用BioRender绘制。所有定量数据以平均值±SD表示，p值采用单因素方差分析评估，*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01，***P ≤ 0.001，****P ≤ 0.0001。

（3）TEV/GC-MF水凝胶疫苗激发强大的肿瘤特异性免疫应答

在B16-OVA肿瘤模型中，TEV/GC-MF水凝胶疫苗展现出 progressively stronger 的肿瘤抑制效果，联合aPD1阻断后疗效最佳，50%小鼠长期存活，而各组体重增长正常，主要器官组织学和血液生化指标无显著异常，生物安全性良好。机制上，TEV/GC-MF组肿瘤内CD8+ T细胞密度达106 cells/mg，显著高于 bolus 疫苗组（73 cells/mg）和对照组（61 cells/mg）；同时Treg细胞（CD25+ FoxP3+）和MDSCs（Gr1+ CD11b+）浸润显著减少。肿瘤内促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6水平显著升高。内源性TRP-2特异性（SVYDFFVWL四聚体+）和模型OVA特异性（SIINFEKL四聚体+）CD8+ T细胞比例在TEV/GC-MF组均显著增加。ELISPOT和流式分析证实，该组再刺激后IFN-γ分泌及IFN-γ+ CD8+ T细胞频率显著高于对照。CD8+ T细胞耗竭实验完全消除了疫苗的抗肿瘤效应，证明CD8+ T细胞是疗效的关键介导者。肿瘤转录组分析显示，疫苗组与对照组差异表达基因涉及T细胞活化、分化、增殖（如Ripk3、Adam8、Il4ra）及抗原加工呈递（如H2-D1）等；GO富集分析显著富集T细胞活化、分化、增殖等免疫相关过程；免疫浸润分析显示活化DCs、活化CD8+ T细胞、NK细胞及效应/中央记忆T细胞显著增加。

图4. TEV/GC-MF水凝胶疫苗激发 robust 的抗原特异性免疫应答及 potent 抗肿瘤功效。a) 各处理组的肿瘤生长曲线。b) 各处理组小鼠的生存曲线，n = 6。c) 归一化至肿瘤重量的绝对CD8+ T细胞计数，n = 4。d) CD4+ T细胞中CD25+ FoxP3+细胞的频率，n = 4。e) 肿瘤组织中Gr1+ CD11b+ MDSCs的比例，n = 4。f) 肿瘤组织中细胞因子表达谱的热图，n = 4。g) 各组CD8+ T细胞中SVYDFFVWL四聚体+的比例，n = 4。h) 各组CD8+ T细胞中SIINFEKL四聚体+的比例，n = 4。i) 免疫后第7天再刺激脾细胞IFN-γ斑点的代表性ELISPOT图像。j) IFN-γ斑点形成单位的定量分析，n = 4。k) 免疫后第7天再刺激脾细胞中CD8+ T细胞IFN-γ+细胞的百分比，n = 4。l) 抗体给药后CD8+ T细胞耗竭的流式细胞术验证。m) 水凝胶疫苗联合CD8+ T细胞耗竭处理小鼠的肿瘤生长动力学，n = 5。n) 生理盐水组与TEV/GC-MF组之间差异表达基因的火山图。o) 生理盐水组与TEV/GC-MF组差异表达基因的热图，n = 3。p) 上调差异表达基因的GO富集分析。q) 生理盐水组和TEV/GC-MF处理肿瘤中的免疫细胞浸润谱。所有数据以平均值±SD表示，p值采用单因素方差分析评估，*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01，***P ≤ 0.001，****P ≤ 0.0001。

（4）快速可定制的个性化TEV/GC-MF疫苗有效抑制远处肿瘤并建立持久免疫记忆

为模拟临床转化流程，团队从切除的小鼠肿瘤中直接分离TEVs制备个性化水凝胶疫苗。在C57BL/6小鼠原发B16肿瘤切除后建立远处肿瘤模型，单次注射个性化TEV/GC-MF疫苗即显著抑制远处肿瘤生长，联合aPD1后生存率达83%（5/6），而游离 bolus 疫苗几乎无效。外周血分析显示，TEV/GC-MF组CD8+ T细胞比例为32.7%，联合组达39.1%，表明疫苗可持续激活 robust 免疫应答。肿瘤再挑战实验中，未接种对照小鼠肿瘤快速生长，而疫苗组肿瘤进展显著受抑，TEV/GC-MF组存活率66.7%（2/3），联合组80%（4/5）。脾脏免疫学分析显示，个性化水凝胶疫苗诱导了 robust 的记忆应答：TEV/GC-MF组中央记忆T细胞（Tcm）和效应记忆T细胞（Tem）分别较初始组升高3.02倍和2.87倍，表明疫苗不仅具有强大抗肿瘤效应，还能建立持久免疫记忆。

图5. 个体化TEV/GC-MF水凝胶疫苗抑制远端肿瘤生长并诱导免疫记忆。（a）个体化TEV/GC-MF疫苗的制备与治疗策略示意图；（b）肿瘤接种、个体化疫苗制备及治疗流程示意图；（c）各组肿瘤生长曲线，n = 6；（d）各组小鼠生存曲线；（e）治疗后外周血中CD8+ T细胞比例，n = 4；（f）再挑战实验中的肿瘤生长曲线，生理盐水组n = 4，TEV/GC-MF组n = 3，TEV/GC-MF + aPD-1组n = 5；（g）再挑战后的生存曲线；（h）初始组、TEV/GC-MF组和TEV/GC-MF + aPD-1组脾脏中中央记忆T细胞（Tcm）和效应记忆T细胞（Tem）的代表性流式图；（i）CD8+ Tcm细胞定量；（j）CD8+ Tem细胞定量。数据以均值 ± SD表示，单因素方差分析，*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01，***P ≤ 0.001，****P ≤ 0.0001。

（5）个性化TEV/GC-MF疫苗有效预防术后肿瘤复发与转移

在模拟临床术后残留病灶的4T1-Luc原位乳腺癌模型中，团队切除约90%原发肿瘤并以切除组织制备个性化疫苗。体内成像显示，生理盐水对照组术后快速出现局部复发和肺转移； bolus 疫苗组亦出现大量复发。相比之下，TEV/GC-MF水凝胶疫苗显著抑制复发和转移，联合aPD1后效果进一步增强。肺部大体观察显示，生理盐水组和 bolus 疫苗组肺组织布满转移结节，而水凝胶疫苗组及联合组几乎未见可见结节，H&E染色证实这一结果；肺转移灶定量分析显示水凝胶疫苗组结节数显著减少。肿瘤复发监测表明， bolus 疫苗无法有效控制复发，而水凝胶疫苗显著抑制复发，TEV/GC-MF组生存率达60%，联合aPD1达80%。免疫学分析揭示，第23天TEV/GC-MF组外周血CD8+ T细胞比例约为生理盐水组的4倍，该差异在第40天仍维持约3倍，表明水凝胶疫苗顺利获得维持持久且 potent 的T细胞介导免疫应答有效控制肿瘤复发和转移。

图6. 个性化TEV/GC-MF水凝胶疫苗减轻术后肿瘤复发与转移。a) 肿瘤接种、个性化疫苗制备及治疗的时间线示意图。顺利获得在BALB/c雌性小鼠乳腺脂肪垫原位接种4T1-Luc细胞建立原位乳腺癌模型。为诱导转移，第15天经尾静脉注射4T1-Luc细胞。第16天手术切除约90%的原发肿瘤作为TEVs分离来源并随后制备个性化水凝胶疫苗。小鼠随后分别用生理盐水、 bolus 疫苗、TEV/GC-MF或TEV/GC-MF联合aPD1治疗。b) 用于监测4T1-Luc转移和复发的体内生物发光成像。c) 各治疗组代表性肺部照片及d) 相应H&E染色切片。比例尺：500 μm。e) 各治疗组肺转移灶的定量分析，n = 5。f) 各治疗组的肿瘤生长曲线及g) 生存曲线，n = 5。h) 第23天及j) 第40天外周血中CD8+ T细胞的比例。i, k) 相应时间点CD8+ T细胞比例的统计分析，n = 4。所有数据以平均值±SD表示，p值采用单因素方差分析评估，**P ≤ 0.01，****P ≤ 0.0001。