bifa必发(中国)

针对现有角化龈修复材料抗菌能力不足、炎症调控有限以及组织再生效果不理想等问题，暨南大学郭瑞教授团队构建了一种具有多重生物功能的夹层结构纳米纤维支架。该支架顺利获得静电纺丝技术制备，由内层PCL@ZnO纳米颗粒膜和外层PCL/rhCol I@Hst-1@ZnO纳米纤维膜组成。其中，ZnO纳米颗粒赋予材料良好的抗菌和抗炎能力，可有效抑制口腔致病菌；重组人Ⅰ型胶原（rhCol I）促进细胞黏附、迁移和组织重塑；Hst-1多肽则进一步增强血管生成能力并调节免疫微环境。研究顺利获得体内外实验验证了该复合支架在抗感染、促进细胞功能、调控炎症以及促进角化龈组织再生方面的综合作用，为口腔软组织缺损修复给予了一种兼具结构支撑和生物调控功能的新型材料策略。该文章于2026年5月22日以《A triple-functional sandwich-like nanofibrous matrix for accelerated gingival augmentation》为题发表于《Journal of Advanced Research》（DOI：10.1016/j.jare.2026.05.023）。

研究示意图：三明治结构纳米纤维基质的制备流程及角化牙龈再生机制示意图

（1）纤维膜的理化性质表征

研究人员第一时间对不同组成的电纺纤维膜进行了结构和理化性能表征。扫描电子显微镜观察显示，纯PCL纤维以及加入rhCol I后的PR纤维均呈现陆续在、均匀的纳米纤维结构，在进一步引入ZnO纳米颗粒和Hst-1后，纤维形貌仍保持稳定，表明功能组分的加入未明显影响电纺纤维结构（图1A）。透射电子显微镜结果显示，ZnO纳米颗粒粒径约为30–50 nm，并均匀分布于纤维内部，证明ZnO成功负载并实现良好分散（图1B）。纤维直径分析表明，与PCL组相比，rhCol I的加入降低了纤维直径，而ZnO纳米颗粒和Hst-1的进一步引入对纤维形成过程产生一定影响，但PR@ZnO@Hst-1纤维仍保持与PR组相近的纳米尺度直径（图1C）。动态接触角测试结果显示，rhCol I、ZnO纳米颗粒和Hst-1的加入均增强了纤维膜表面亲水性，其中PR@ZnO@Hst-1纤维表现出最低接触角，提示其具有更优异的润湿性能，有利于细胞黏附和组织再生（图1D）。EDS元素分析进一步证实，PR@ZnO@Hst-1纤维中氮元素和锌元素均匀分布，说明rhCol I/Hst-1以及ZnO纳米颗粒均成功整合至纤维网络中，且未出现明显团聚现象（图1E）。FTIR结果显示，复合纤维中出现PCL、rhCol I和ZnO对应的特征吸收峰，证明主要组分成功引入纤维体系，而Hst-1由于与rhCol I存在相似特征峰，其负载情况结合后续释放实验进一步验证（图1F）。此外，圆二色谱分析显示，Hst-1在电纺溶剂HFIP中仍保持一定的α-螺旋结构，加入ZnO纳米颗粒后其二级结构发生变化，提示ZnO可能与Hst-1产生相互作用，并影响其构象状态（图1G）。

图1. 不同组成电纺纤维膜的表征。 (A) 纤维膜的扫描电子显微镜（SEM）图像。(B) ZnO纳米颗粒及其在电纺纤维中的分布透射电子显微镜（TEM）图像。(C) 纤维直径分布直方图（n = 100）。(D) 不同时间点纤维膜接触角变化测试（n = 5）。(E) PR@ZnO@Hst-1纤维的扫描电子显微镜能谱（EDS）分析，显示C、N、O和Zn元素分布。(F) 不同纤维膜的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。(G) Hst-1在PBS、HFIP以及含ZnO纳米颗粒的HFIP体系中的圆二色谱（CD）分析。

（2）纤维膜的溶胀、降解行为及力学性能评价

研究人员进一步对不同组成纤维膜的吸水性能、降解行为、功能分子释放以及力学性能进行了评价。溶胀实验显示，PR@ZnO@Hst-1纤维膜具有最高的吸水能力，24 h后溶胀率达到约160%，说明rhCol I、Hst-1和ZnO纳米颗粒的引入增强了材料亲水性，有利于细胞黏附和组织修复（图2A）。在模拟口腔环境的人工唾液中，所有纤维膜均表现出逐渐降解趋势，其中PR@ZnO@Hst-1外层膜降解速度较快，而P@ZnO内层膜保持较好的结构稳定性，体现了双层膜在降解速率上的互补设计（图2B）。在含Ⅰ型胶原酶的环境中，含Hst-1的纤维膜表现出更快降解行为，进一步说明其能够响应富含酶的组织环境（图2C）。同时，PR@ZnO@Hst-1纤维膜能够持续释放Zn²⁺和Hst-1，其中Zn²⁺释放持续超过20天，而Hst-1在早期快速释放，有助于发挥抗菌和促修复作用（图2D–E）。

此外，所有纤维膜均具有较高孔隙率（>75%），其中含rhCol I的纤维膜孔隙率更高，有利于细胞浸润和营养交换（图2F）。SEM观察进一步验证了PR@ZnO@Hst-1具有更快的降解过程（图2G），热分析结果表明ZnO和Hst-1的加入能够调节纤维膜的热学性质（图2H–I）。力学测试显示，P@ZnO内层膜和PR@ZnO@Hst-1外层膜的杨氏模量与天然牙龈组织接近，其中PR@ZnO@Hst-1表现出更好的韧性、拉伸性能和力学稳定性（图2J–M）。

图2. 不同组成电纺纤维膜的性能表征。 (A) 不同纤维膜随时间变化的膨胀曲线。(B) 不同纤维膜在人工唾液溶液中的降解曲线。(C) 不同纤维膜在含Ⅰ型胶原酶PBS溶液中的降解曲线。(D–E) 纤维膜中Zn²⁺（D）和Hst-1（E）的释放曲线。(F) 不同纤维膜的孔隙率分析。(G) P@ZnO和PR@ZnO@Hst-1纤维在第0、3、7和14天的扫描电子显微镜图像。(H–I) 热重分析（TGA）（H）和差示扫描量热分析（DSC）（I）曲线。(J) 不同纤维膜的应力–应变曲线。(K–M) 不同纤维膜的力学性能分析，包括极限拉伸强度（K）、杨氏模量（L）和断裂应变（M）（n ≥ 3）。

（3）纤维膜的抗菌及抗生物膜性能评价

研究人员进一步评价了复合纤维膜对口腔主要致病菌变形链球菌（S. mutans）和牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的抗菌作用。扫描电子显微镜观察发现，对照组和P组纤维表面均有大量细菌黏附和聚集，而含ZnO纳米颗粒的纤维膜能够明显减少细菌附着，其中PR@Hst-1@ZnO组表面几乎未观察到明显细菌，表现出较强的抗菌黏附能力（图3A）。菌落形成实验进一步验证了这一结果，含ZnO纳米颗粒的纤维膜均显著降低了细菌增殖，其中PR@Hst-1@ZnO组表现出最强的抑菌效果（图3B）。细菌存活率分析显示，PR@ZnO和PR@Hst-1@ZnO对S. mutans和P. gingivalis均具有超过90%的杀菌效率，而P@ZnO由于降解较慢，抗菌效果略低（图3C），说明ZnO纳米颗粒是赋予纤维膜抗菌性能的关键因素。

进一步顺利获得扫描电子显微镜观察细菌形态发现，经PR@Hst-1@ZnO处理后，S. mutans和P. gingivalis均出现细胞膜破裂和结构损伤，表明该材料能够顺利获得破坏细菌膜结构发挥杀菌作用（图3D）。此外，Hst-1与Zn²⁺之间的相互作用可能进一步增强材料与细菌表面的结合，从而协同提高抗菌效果。

在抗生物膜性能方面，共聚焦显微镜观察和生物膜厚度分析显示，对照组和P组形成了完整的细菌生物膜，厚度约20 μm；而含ZnO纳米颗粒的纤维膜显著抑制了生物膜形成，其中PR@Hst-1@ZnO组抑制效果最明显，生物膜厚度降低至5 μm以下，同时表现出更高的细菌死亡信号（图3E–F）。结晶紫染色结果进一步证实，含ZnO和Hst-1的复合纤维膜能够明显减少生物膜形成（图3G）。

此外，研究人员还评价了材料对口腔常见机会性真菌白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力，结果显示PR@Hst-1@ZnO纤维膜具有约91.7%的真菌抑制率，高于单独负载ZnO的纤维膜，提示Hst-1可能进一步增强材料的广谱抗微生物作用。

图3. 电纺纤维膜对变形链球菌（S. mutans，S. m.）和牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis，P. g.）的抗菌性能。 (A) 不同纤维膜表面黏附的S. m.（上图）和P. g.（下图）的扫描电子显微镜图像，细菌采用伪彩色标记。(B) 不同纤维膜处理后细菌在琼脂平板上的菌落形成情况。(C) 细菌死亡率分析，不同字母表示组间具有显著性差异（p < 0.05）。(D) 对照组和PR@Hst-1@ZnO纤维处理后细菌形态的扫描电子显微镜图像。(E) 细菌生物膜的共聚焦显微镜观察，绿色荧光表示存活细菌，红色荧光表示死亡细菌。(F) 生物膜厚度统计分析。(G) 结晶紫染色检测细菌生物膜形成。

(4) 电纺纤维膜的细胞相容性评价

研究人员进一步顺利获得CCK-8检测、活死染色、细胞迁移实验、细胞骨架染色以及扫描电子显微镜观察等多种方法，系统评价不同电纺纤维膜对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人牙龈成纤维细胞（HGF-1）的生物相容性及细胞调控能力（图4）。CCK-8结果显示，各组纤维膜均未对HUVECs和HGF-1细胞活力产生明显抑制作用，部分实验组在培养48 h后表现出高于对照组的细胞活性，其中含Hst-1的PR@Hst-1和PR@Hst-1@ZnO组细胞增殖效果更为明显，说明Hst-1的引入能够促进细胞活性，同时未受到ZnO纳米颗粒潜在细胞毒性的影响（图4A–B）。活死染色结果进一步显示，PR@Hst-1和PR@Hst-1@ZnO组具有较高的绿色荧光信号和较少的红色死亡细胞，表明这些纤维膜具有良好的细胞相容性（图4C）。细胞迁移实验结果显示，PR@Hst-1@ZnO组能够显著促进HGF-1和HUVECs迁移，迁移细胞数量明显增加，提示该复合纤维膜不仅具有良好的生物安全性，还能够促进与组织修复相关的细胞行为（图4D）。此外，Phalloidin染色显示，HGF-1细胞在PR@Hst-1和PR@Hst-1@ZnO纤维膜表面表现出更明显的铺展状态和完整的细胞骨架结构（图4E）；SEM观察进一步证实，PR@Hst-1@ZnO组细胞呈现较好的伸展形态，并与纤维表面形成紧密黏附（图4F）。

图4. 纤维膜的生物相容性评价。 (A) 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和(B) 人牙龈成纤维细胞（HGFs）在不同纤维膜处理24 h和48 h后的CCK-8检测结果（n = 4），不同字母表示具有统计学差异（P < 0.05）。(C) HGF-1和HUVECs细胞活死染色分析（n = 4）。(D) HGF-1和HUVECs细胞迁移实验（n = 4）。(E) 利用鬼笔环肽（Phalloidin）荧光染色观察HGF-1细胞黏附情况（n = 4）。(F) 不同电纺膜表面HGF-1细胞黏附形态的扫描电子显微镜图像。

(5) 纤维膜促进血管生成及组织修复功能评价

研究人员进一步顺利获得细胞迁移、血管生成以及细胞外基质（ECM）重塑相关实验，评价不同电纺纤维膜在促进软组织修复过程中的功能作用。划痕实验结果显示，PR@Hst-1和PR@Hst-1@ZnO组在培养36 h后表现出明显的伤口闭合，而对照组、P组和P@ZnO组修复效果较弱（图5A）。定量分析显示，PR@Hst-1和PR@Hst-1@ZnO组伤口闭合率均达到约80%，显著高于其他组，说明Hst-1的引入能够有效促进细胞迁移（图5B）。

进一步的管腔形成实验表明，PR@Hst-1和PR@Hst-1@ZnO组能够明显增强HUVECs血管样结构形成，提高血管节点数、分支数量、网络数量以及管段长度等指标，其中PR@Hst-1@ZnO组在各项血管生成指标中均表现最佳，提示ZnO与Hst-1可能共同增强材料的促血管生成能力（图5C–D）。免疫荧光染色结果进一步显示，PR@Hst-1@ZnO组具有更强的VEGF表达信号，同时保持良好的F-actin细胞骨架结构，表明该材料能够促进血管生成相关因子表达并维持细胞功能状态（图5E）。

此外，ELISA检测结果显示，PR@Hst-1@ZnO组中VEGF和Col1a1表达水平最高，分别达到约330 pg/mL和5.2 ng/mL，而与胶原降解相关的MMP-8表达明显降低（图5F–H）。这一结果提示，该复合纤维膜不仅能够促进血管生成和胶原合成，同时还能减少细胞外基质过度降解，有利于组织结构重建和创面修复。

图5. 电纺纤维膜促进血管生成、细胞迁移及细胞外基质重塑功能验证。 (A–B) HUVECs在36 h时的划痕愈合实验及伤口闭合率定量分析。(C) 管腔形成实验。(D) 血管生成相关指标定量分析，包括节点数、网络数、分支数和管段长度。(E) HUVECs中F-actin（绿色）、VEGF（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色。(F–H) ELISA检测P. gingivalis LPS刺激后HUVECs中血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-8（MMP-8）和Ⅰ型胶原α链（Col1a1）的表达水平（n = 6），不同字母表示具有统计学差异（P < 0.05）。

(6) 纤维膜的免疫调控作用评价

研究人员进一步利用牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P. gingivalis LPS）刺激RAW264.7巨噬细胞，模拟牙周炎和种植体周围炎等慢性感染微环境，评价复合纤维膜对巨噬细胞极化和炎症调控的作用（图6A）。免疫荧光结果显示，P. gingivalis LPS刺激后，巨噬细胞向促炎M1型极化，表现为iNOS和CD86表达增强；而加入含Hst-1的纤维膜后，iNOS和CD86表达降低，同时M2型标志物CD206表达升高，表明材料能够促进巨噬细胞由炎症型M1表型向修复型M2表型转变（图6B）。定量分析进一步证实，PR@Hst-1@ZnO组具有最高的CD206表达水平，同时显著降低iNOS和CD86表达，显示出更强的免疫调节能力（图6C）。

此外，炎症因子检测结果显示，P. gingivalis LPS刺激导致巨噬细胞M1/M2比例明显升高，而含rhCol I的PR组能够一定程度促进M2表型形成，降低炎症状态；进一步加入Hst-1后，PR@Hst-1和PR@Hst-1@ZnO组均显著促进M1向M2表型转化，使M1/M2比例降低至0.3–0.6范围，表现出更明显的免疫调节作用（图6D）。这些结果表明，Hst-1在复合纤维膜中发挥了重要的免疫调控作用，而rhCol I和Hst-1的协同作用能够改善感染相关炎症微环境，促进巨噬细胞向组织修复相关表型转变。进一步顺利获得ELISA检测炎症因子表达情况发现，P. gingivalis LPS刺激后，巨噬细胞中促炎因子TNF-α水平明显升高（>170 pg/mL），而PR@Hst-1@ZnO组能够显著降低TNF-α表达，同时提高抗炎因子IL-10水平，进一步说明该复合纤维膜能够有效改善炎症微环境（图6E）。

图6. 对巨噬细胞极化的免疫调节作用。 (A) 示意图展示P. gingivalis LPS刺激下巨噬细胞由M0型向M1型极化，以及在Hst-1作用下向M2型转化的过程。(B) RAW264.7巨噬细胞免疫荧光染色，检测不同处理条件下M1型标志物CD86和M2型标志物CD206的表达。(C) CD86和CD206荧光综合强度定量分析。(D) ELISA检测炎症因子TNF-α和IL-10表达水平（n = 6），不同字母表示具有统计学差异（P < 0.05）。

(7) 比格犬模型中角化龈增量效果及三维组织体积分析

为验证复合纤维膜在角化龈增量治疗中的应用潜力，研究人员建立了比格犬牙龈生物型改建模型，并采用隧道瓣技术植入不同材料，评价其软组织增量效果（图7A–B）。实验组包括自体上皮下结缔组织移植组（SCTG）、商业胶原基质组（CM）、不含Hst-1的复合膜组（PRZ）、不含ZnO的复合膜组（PRH）以及同时含有ZnO和Hst-1的双层复合膜组（PRHZ）。

术后牙周指标检测显示，SCTG、CM和PRZ组在术后2周出现较高的探诊深度（PD）和出血指数（BI），提示存在一定程度的炎症反应；而PRH和PRHZ组仅表现出轻微炎症反应。随着恢复时间延长，PRH和PRHZ组的PD和BI逐渐恢复至基线水平，说明Hst-1的引入有助于调节局部炎症环境。在术后8周，PRHZ组角化龈厚度增加最明显，厚度提升达到0.57 ± 0.04 mm，明显高于SCTG组（0.29 ± 0.02 mm）和CM组（0.24 ± 0.02 mm），表现出更优异的软组织增量效果（图7A–B）。术后2周创面观察进一步显示，各组均具有较好的愈合表现，其中PRHZ组表现出更完整的创面闭合、更平整的组织表面以及更低程度的炎症反应，体现出良好的组织相容性和修复能力（图7C）。

为了进一步定量分析软组织体积变化，研究人员利用术前和术后4周的牙模型进行三维重建，顺利获得模型叠加和差异分析取得组织增厚分布热图（图7D–E）。结果显示，PRHZ和PRH组在颊侧牙龈区域均出现陆续在且均匀的组织增厚，表明其能够有效促进软组织扩增。术后8周三维定量分析进一步显示，PRHZ和PRH组在平均组织厚度增加、表面积增加以及组织体积增加等指标上均显著优于SCTG和CM组（图7F–H）。其中，PRHZ组角化龈区域新增组织体积达到153 ± 5 mm³，高于Geistlich Mucograft®组（63 ± 5 mm³）和自体移植组（92 ± 6 mm³）。

进一步与已有比格犬模型研究进行比较发现，本研究中PRHZ和PRH组取得的牙龈厚度增加值明显高于既往胶原基质材料，进一步说明该复合纤维膜具有更强的组织扩增能力（图8）。相比天然胶原基质容易在湿润口腔环境中快速降解和塌陷，电纺纤维膜能够给予更加稳定的空间支撑，同时结合rhCol I、Hst-1和ZnO的生物调控作用，促进血管形成、免疫调节和组织重建。

图7. 比格犬模型中的牙龈增量效果评价。 (A) 术前牙周测量和牙模型采集示意图。(B) 实验组软组织移植及植入手术建模过程。(C) 术后2周创面愈合图像。(D) 术前及术后4周模型的三维表面重建和叠加图像。(E) 术前与术后4周模型差值分析后的组织增长分布热图。(F–H) 术后8周模型中平均组织厚度、增加的表面积以及增加的组织体积定量分析（n = 4）。(I) 术后4周牙龈组织H&E染色结果，不同字母表示具有统计学差异（P < 0.05）。

图8. 不同基质材料用于角化龈增量治疗时角化龈厚度（GT）的增加值比较。（图中所列文献均选自相同比格犬模型，并且植入基质体积相近的研究。）

(8) 再生牙龈组织的组织学评价

为了进一步评价不同修复材料对牙龈组织胶原沉积、纤维排列以及血管生成的影响，研究人员对术后4周和8周的组织切片进行了HE染色、Masson染色、天狼猩红染色偏振光分析以及免疫组织化学检测。

HE染色结果显示，SCTG组和PRHZ组均形成了较为致密、有序的结缔组织结构，并具有完整的上皮层和丰富的血管分布；相比之下，商业胶原基质（CM）组组织结构较为疏松，胶原纤维排列紊乱，提示其在体内组织重塑过程中的支撑能力有限（图7I）。Masson染色进一步显示，术后4周各组均出现一定程度的胶原沉积，其中PRHZ和PRH组表现出更加致密且排列规则的胶原纤维结构，蓝色胶原纤维分布更加均匀，说明复合纤维膜能够促进早期胶原生成和组织结构重建（图9A）。

顺利获得天狼猩红染色及偏振光观察进一步分析Ⅰ型和Ⅲ型胶原分布发现，术后4周PRHZ和PRH组已经出现大量排列有序的黄红色粗纤维，代表Ⅰ型胶原沉积，表现出与正常牙龈组织相似的胶原结构；随着时间延长至8周，两组Ⅰ型胶原比例进一步提高，胶原束逐渐成熟。相比之下，CM组主要表现为细小且排列无序的胶原纤维，而SCTG组虽然存在胶原积累，但组织结构仍较松散，提示材料组成和结构对胶原成熟过程具有重要影响（图9B）。胶原定量分析进一步证实，PRZ、PRHZ和PRH组胶原面积比例均超过60%，明显高于其他组，表现出更强的早期胶原沉积能力（图9C）。同时，Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例分析显示，PRH和PRHZ组在术后4周和8周均维持较高水平，且术后8周Ⅰ型胶原比例提升至约240%，表明该材料能够促进胶原组织由早期修复阶段向成熟重塑阶段转变（图9D）。

免疫组织化学分析进一步揭示了材料促进组织再生的潜在机制。CD31染色显示，PRHZ组具有更加丰富的新生血管分布，提示其具有较强的促血管生成能力；VEGF染色结果显示，PRHZ和PRH组均表现出较高VEGF表达水平，说明Hst-1和rhCol I能够促进血管生成相关信号激活。同时，Col-I染色显示两组Ⅰ型胶原沉积明显增强，与Masson染色和偏振光分析结果一致（图9E）。

图9. 再生牙龈组织的组织学评价。 (A) 术后4周Masson三色染色分析。(B) 术后4周和8周Picro Sirius Red染色偏振光观察，其中橙红色信号代表Ⅰ型胶原，绿色信号代表Ⅲ型胶原。(C) Masson染色切片中胶原面积比例定量分析（n = 6）。(D) 基于双折射分析计算Ⅰ/Ⅲ型胶原比例（n = 6）。(E) 术后4周CD31、VEGF和Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）的免疫组织化学染色，不同字母表示具有统计学差异（P < 0.05）。