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研究背景：

     针对上述问题，中国药科大学涂家生教授、姜雷副教授和南京大学蒋锡群教授团队构建了一种“二聚铜肽-ROS响应水凝胶”一体化敷料（G/D-CuP）：顺利获得将二聚铜肽（D-CuP）载入可清除ROS并随ROS浓度智能释药的凝胶基质，实现了“一剂多靶”——同步抗炎、抗氧化、促血管新生和促成纤维细胞迁移，二聚结构利用空间位阻显著提升肽酶稳定性，凝胶柔软可形变，能贴合任意创面，且制备简便、成本低，具备可观的临床转化潜力。该文章于2025年7月1日以《Dimeric copper peptide incorporated hydrogel for promoting diabetic wound healing》为题发表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-61141-1）。

整合二聚铜肽的水凝胶（G/D-CuP）促进糖尿病创面愈合效率。a. G/D-CuP的制备示意图；b. G/D-CuP在糖尿病创面愈合过程中的作用

（1）D-CuP的制备与表征

顺利获得赖氨酸桥联两分子GHK三肽合成了二聚肽D-P（图1a），其结构经¹H NMR、¹³C NMR及HRMS确认。D-P与Cu²⁺以1:0.5摩尔比络合得到蓝紫色D-CuP，UV-Vis在584 nm处出现明显吸收峰（图1b），与单体铜肽M-CuP的峰位一致，但在相同配位基团摩尔浓度下吸光度显著高于M-CuP，表明D-P具有更高的配位效率与稳定性（图1c、d）。EPR在约3426 mT处检测到Cu²⁺特征信号，进一步证实D-CuP生成（图1e）。在模拟皮肤生理（pH 4-6）及慢性创面碱性（pH 7-9）环境中，584 nm吸收峰保持稳定，说明D-CuP在pH 4-9范围内结构完整。以广谱蛋白酶K进行的体外降解实验显示，0.5 h后M-CuP剩余58%，4 h后降至50%；而D-CuP在相同时间点分别剩余92%和87%，证明二聚结构显著提高了抗酶解稳定性（图1f）。

图1. D-CuP的制备与表征。a. D-CuP结构式；b. D-CuP溶液颜色；c、d. D-CuP的紫外-可见吸收光谱；e. D-CuP的电子顺磁共振谱；f. M-CuP与D-CuP经蛋白酶K处理的稳定性曲线

（2）G/D-CuP的制备与表征

图2a所示，EBPBA与PVA经苯硼酸酯键交联，并在室温下与D-CuP共混5 s即得G/D-CuP水凝胶。SEM显示水凝胶内部为三维互通多孔网络，孔径约50-100 µm（图2b）。动态流变测试表明，在0.1%–1200%振荡应变及0.1–500 rad·s^-1角频率范围内，储能模量G’始终保持在2500 Pa左右并高于损耗模量G’’，证实其弹性固体特性（图2c、d）。陆续在阶跃应变实验显示，当应变由0.1%骤升至1200%时G’由2500 Pa降至390 Pa，应变恢复后G’瞬时回升至2500 Pa（图2e）；宏观切片实验进一步验证，水凝胶在被切断后5 s内断面完全愈合，可承受180°弯折而不产生裂纹（图2f）。在星形及不规则创面上，G/D-CuP可在10 s内完全铺展并填充所有缝隙，粘附强度达12 kPa，有效封闭创面（图2g）。体外ROS响应释放实验表明，在1 mM H₂O₂刺激下，D-CuP在72 h内累积释放90%（图2h）。

图2. G/D-CuP的制备与表征。a. G/D-CuP的制备流程；b. G/D-CuP的典型SEM图像；c. G/D-CuP的流变学—应变扫描；d. G/D-CuP的流变学—频率扫描；e. G/D-CuP的陆续在阶跃应变测试；f. G/D-CuP的自修复性能；g. G/D-CuP的形变与贴合能力；h. G/D-CuP在PBS与H2O2条件下的累积释放曲线

（3）G/D-CuP的体外抗炎效应与抗氧化能力

在LPS/IFN-γ诱导的RAW 264.7炎症模型中，G/D-CuP处理使CD86⁺ M1巨噬细胞比例由78.9%降至36.4%，同时CD206⁺ M2群体由3.1%升至12.2%，极化效果显著优于M-CuP（图 3a–d）。炎症因子水平同步下降：TNF-α由320 pg·mL^-1降至95 pg·mL^-1，IL-6由410 pg·mL^-1降至120 pg·mL^-1（图 3e、f）。ROS清除方面，Fenton体系中G/D-CuP对羟自由基的清除率超过95%；胞内DCFH-DA荧光检测显示，H₂O₂刺激下G/D-CuP组ROS荧光强度较阴性对照下降71%，且SOD活性较G/M-CuP组提高1.8倍（图 3g、h）。血液相容性实验进一步表明，G/D-CuP的溶血率低于5%，符合生物材料安全要求（图 3i）。

图3. G/D-CuP的体外抗炎效应与抗氧化能力。a. 不同处理后巨噬细胞表型的代表性荧光图；b. 不同处理后RAW 264.7细胞CD206与CD86表达的流式细胞术分析；c. M1（CD86⁺、CD206^-）表型巨噬细胞统计；d. M2（CD206⁺、CD86^-）表型巨噬细胞统计；e. TNF-α与f. IL-6 浓度由ELISA测定；g. G/D-CuP处理后NIH-3T3细胞的ROS荧光图像；h. G/D-CuP处理后NIH-3T3细胞的SOD活性检测；i. G/D-CuP的溶血率

（4）G/D-CuP体外促进细胞增殖、迁移及血管生成作用

在图4a、b所示的Ki67免疫荧光及定量分析中，G/D-CuP使HUVEC增殖率升至69%，显著高于所有对照；图4c的MTT结果显示，D-CuP在低浓度下对NIH/3T3的促增殖活性优于M-CuP，且G、D-CuP、G/D-CuP三组的细胞存活率均保持在90%以上，未见细胞毒性。进一步地，图4d、e的管腔形成实验显示，G/D-CuP组的管腔总长度及网格数均显著高于其余处理组；图4f的VEGF ELISA结果同样提示其促血管生成能力显著增强。迁移能力方面，图4g、h的Transwell实验表明G/D-CuP显著促进成纤维细胞迁移；图4i、j的划痕实验亦显示D-CuP在30 h内使L929细胞划痕闭合率高于M-CuP，提示二聚铜肽因稳定性及活性提升而加速创面修复。

图4. G/D-CuP的体外促细胞增殖、迁移与血管生成作用。a. HUVEC细胞经不同处理后Ki67免疫荧光代表性图像；b. Ki67⁺细胞定量分析；c. NIH/3T3细胞与D-CuP或M-CuP共培养24 h后的相对细胞活力；d. 经calcein-AM染色（绿色）的HUVEC细胞管腔形成实验代表性图像；e. 总管长定量分析；f. ELISA测定VEGF浓度；g. L929细胞Transwell迁移实验代表性图像；h. 迁移细胞数定量分析；i. L929 细胞划痕实验不同时间点图像；j. 划痕愈合率随时间变化

（5）D-CuP治疗作用的蛋白质组学分析

图5a所示流程下，对L929纤维肉瘤细胞行定量蛋白质组学检测；图5b的PCA图显示D-CuP组与PBS组蛋白表达谱明显分离。差异蛋白火山图（图5c）共筛得74个DEP（29个上调、45个下调，p<0.05，|FC|>1.2）。按愈合三阶段分类，炎症与氧化应激相关蛋白Cop1、H2-D1、Ndufa6、Fam76a显著下调，增殖、迁移及血管生成相关蛋白Slc38a2、Psph、Jagn1、Rorb显著上调（图5d）。GO富集（图5e）揭示分子功能调节、转运活性、细胞膜组分、细胞过程与生物调控为主要条目；KEGG通路（图5f）则聚焦核苷酸切除修复、p53、mTOR、IL-17、NOD样受体及HIF-1信号轴。分子对接（图5g）给出D-CuP对p53 DNA结合域和HDAC7催化域的结合能分别为-5.7 kcal·mol^-1与-6.4 kcal·mol-¹，显著优于M-CuP的-4.2 kcal·mol^-1与-4.8 kcal·mol^-1。SPR动力学（图5h）进一步测定D-CuP与p53、HDAC7的平衡解离常数KD分别为3.8×10^-6 M和1.81×10^-6 M，而M-CuP在各浓度下响应均<5 RU，证实二聚结构顺利获得多价协同增强靶点结合。

图5. D-CuP干预前后L929细胞的蛋白质组学评估。a. 蛋白质组学分析流程示意图；b. 基于两组L929细胞差异表达蛋白的PCA主成分分析；c. D-CuP处理后上调与下调基因的火山图；d. 差异蛋白热图；e. D-CuP组与对照组差异蛋白的GO功能分析；f. D-CuP组与对照组差异蛋白的KEGG通路富集；g. p53与M-CuP、p53与D-CuP、HDAC7与M-CuP、HDAC7与D-CuP分子对接示意图；h. SPR测定M-CuP与D-CuP对p53或HDAC7的结合亲和力

（6）G/D-CuP促进糖尿病创面愈合的效果

图6a所示体内实验将糖尿病小鼠创面随机分为PBS（NC）、G、M-CuP、D-CuP、G/M-CuP及G/D-CuP六组，并以健康鼠PBS处理作为空白对照（BC）。图6b、c的宏观照片记录显示，第3天起各治疗组创面面积已明显小于NC；第7天G/D-CuP组剩余面积仅17.3%，优于其余各组（图6d）。到第12天，NC与M-CuP组仍分别残留34.2%与17.8%创面，D-CuP组降至9.8%，而G/D-CuP组仅余2.8%。组织学层面，图6e的H&E染色表明，第7天G/D-CuP组已形成致密肉芽组织，第12天完成表皮覆盖并可见大量新生毛囊与皮脂腺；图6f定量显示其肉芽厚度显著高于其他组，提示G/D-CuP在加速糖尿病创面闭合、促进皮肤附件再生及提升愈合质量方面具有最显著优势。

图6. G/D-CuP促进糖尿病创面愈合的效果。a. 各组动物实验时间轴示意图；b. 不同处理组创面代表性照片；c. 第0、3、7、12天各组创面愈合情况对比；d. 12天内创面愈合率；e. 第12天各处理组创面组织H&E染色；f. 第12天各组肉芽组织厚度

图7a、b的第3天ELISA结果显示，G/D-CuP组创面IL-6水平最低、IL-10最高，提示炎症期提前结束；图7c的第7天组织染色进一步验证TNF-α与IL-6下调、IL-10上调。进入增殖期，图7d的第3天VEGF ELISA及图7c、e的第7天免疫组化表明，G/D-CuP组VEGF与CD31表达均最高，CD31平均光密度比G/M-CuP组提高1.48倍；第12天该组新生血管数量已显著减少，显示血管生成被适时终止，重塑期提前启动。图7c、f的Ki67染色显示，G/D-CuP组第7天细胞增殖信号最强，第14天迅速回落；Masson三色（图7g）表明其胶原密度、厚度及排列方向均优于G/M-CuP组，接近健康皮肤结构。

图7. G/D-CuP加速糖尿病创面三期修复。ELISA测定第3天创面 a. IL-6、b. IL-10、d. VEGF浓度；c. 第7天TNF-α、VEGF、CD31、Ki67免疫组化代表性图像及第12天Masson染色代表性图像；e. 第7天CD31、f. Ki67免疫组化定量分析；g 第12天各组胶原沉积定量