bifa必发(中国)

针对上述问题，武汉大学黄翠和张先正研究团队提出基于红细胞仿生的纳米囊泡（GLR）用于牙周炎治疗的新策略。研究发现，P. gingivalis顺利获得与红细胞聚集和裂解来获取铁和血红素，这对细菌的生长和毒力至关重要。该团队开发的GLR能够精准靶向并黏附于P. gingivalis，利用其对铁的需求，将具有抗菌活性的镓卟啉递送至细菌内部，破坏细菌代谢过程。GLR在蓝光照射下可产生大量活性氧（ROS），与镓离子的代谢干扰协同作用，显著增强对P. gingivalis的杀伤效果。体外实验表明，GLR能有效抑制P. gingivalis生长，减少其对上皮细胞的侵袭，减轻炎症反应。在牙周炎大鼠模型中，GLR联合光疗显著减少了P. gingivalis在龈下菌斑中的比例，抑制了牙槽骨吸收，降低了牙龈出血指数，减少了炎症因子表达。该策略为牙周炎精准治疗给予了新思路。该文章于2024年7月19日以《Erythrocyte-Mimicking Nanovesicle Targeting Porphyromonas gingivalis for Periodontitis》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c02316）。

图1 P. gingivalis与GLR的相互作用示意图。（a）P. gingivalis与GLR聚集并将其裂解以获取镓卟啉，随后因代谢紊乱和光动力治疗而死亡；（b）GLR顺利获得扰乱细菌代谢和光动力作用抑制P. gingivalis；（c）牙周袋中的P. gingivalis被GLR包裹，削弱了它们对上皮细胞的侵袭

（1）红细胞与P. gingivalis之间的相互作用

P. gingivalis可顺利获得血凝素粘附到红细胞上，破坏红细胞膜并利用储存血红素。实验中，P. gingivalis与变形链球菌和大肠杆菌Nissle 1917对红细胞的粘附能力对比显示，P. gingivalis对红细胞粘附性更强（图2A），其（蓝色）多粘附于红细胞（红色）表面并聚集成簇。Transwell实验表明，P. gingivalis更易迁移到含血红素和红细胞的培养基中（图2B、C）。这些结果证实了P. gingivalis与红细胞的相互作用，为构建靶向P. gingivalis的红细胞仿生纳米囊泡给予了依据。

图2 P. gingivalis与红细胞相互作用及相关材料表征。（a）P. gingivalis与红细胞粘附的SEM图像；（b）Transwell实验图像；（c）数据分析；（d）P. gingivalis与红细胞聚集并利用铁卟啉的示意图；（e）铁卟啉（左）和镓卟啉（右）的化学结构；（f）负载镓卟啉的红细胞膜脂质体（GLR）的示意图；（g）GLR合成过程中的zeta电位变化；（h）RBC、LP、LR、GLP和GLR的SDS-PAGE分析；（i）LP、LR、GLP和GLR的粒径；（j）GLR的TEM图像和（k）SEM图像；（l）LP、LR、GLP和GLR的UV-vis吸收光谱；（m）在蓝光下LP、LR、GLP和GLR的荧光光谱；（n）顺利获得DCFH检测镓卟啉（G）、LP、LR、GLP和GLR在蓝光下产生的ROS

（2）GLR 与 P. gingivalis 的粘附情况

电感耦合等离子体质谱（ICP）分析显示，GLR组中粘附或被P.gingivalis吸收的镓离子数量约为GLP组的两倍（图3A）。P.gingivalis与GLR混合后粒径增大（图3B）。透射电子显微镜（TEM）图像显示，GLR与P.gingivalis粘附性强，能包裹P.gingivalis，而GLP与P.gingivalis粘附性弱（图3C）。高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）图像显示，经GLR处理的P.gingivalis内有少量镓离子聚集（图3D）。约23.2%的P.gingivalis细胞与GLR粘附，与GLP粘附的P.gingivalis细胞仅约1.41%（图3E）。在更生理环境下，将人类龈下菌斑与P.gingivalis共培养形成生物膜并用GLR处理，倒置显微镜结果显示，GLR（用DIL标记为红色）仍能很好地聚集到P.gingivalis上，混合细菌生物膜用Hoechst 33342标记为蓝色（图3F），表明GLR在体内复杂环境中靶向龈下菌斑中的P.gingivalis具有可行性。

（3）GLR 在刺激下产生活性氧（ROS）

GLP和GLR产生细胞外ROS能力无显著差异（图3G），提示镓卟啉在蓝光下产生活性氧的能力与其是否粘附在细菌表面或游离于溶液中无关。经GLR处理的P.gingivalis中氧化应激状态细胞比例约11.9%，显著高于其他对照组（<5%）（图3H），其平均荧光强度（MFI）也显著高于其他组（图3I），可能因GLR粘附于P.gingivalis细胞表面甚至部分进入细菌内部，在蓝光照射下，除卟啉自身产生ROS外，细菌自身应激反应产生的ROS几乎可忽略不计。

（4）GLR 与 P. gingivalis 的降解实验

P.gingivalis可顺利获得血凝素（如HagA）、gingipain的粘附域（Kgp和HRgpA）及其他蛋白（如HBP35）与红细胞结合，其释放的溶血素和其他蛋白酶会破坏红细胞膜，导致血红蛋白释放。透射电子显微镜（TEM）图像显示，GLR在P.gingivalis上清液中发生降解（图3J），表明GLR成功模仿红细胞，且P.gingivalis可进一步降解GLR以利用其中的镓卟啉。在P.gingivalis存在时，GLR中镓卟啉的释放量显著低于其不存在时（图3K），可能是由于GLR的降解以及P.gingivalis对镓卟啉的利用，导致镓卟啉释放量减少。

图3 P.gingivalis与GLP、GLR相互作用的表征。（a）顺利获得ICP分析P.gingivalis与GLP或GLR共孵育后Ga³⁺离子浓度；（b）P.gingivalis与GLP或GLR聚集后的粒径变化；（c）P.gingivalis与GLP或GLR共孵育30分钟后的TEM图像；（d）P.gingivalis与GLR共孵育后的HAADF-STEM图像及C、O和Ga元素分布；（e）流式分析显示用SYTO 9标记的P.gingivalis与用DIL标记的GLP或GLR的粘附情况；（f）用DIL标记的GLR与含Hoechst 33342标记的人类龈下菌斑和SYTO 9标记的P.gingivalis共建的生物膜的荧光图像；（g）用DCFH检测P.gingivalis在与PBS、LP、LR、GLP和GLR共孵育并在蓝光下处理后的细胞外ROS产生；（h）流式分析和（i）荧光强度显示P.gingivalis在用PBS、LP、LR、GLP或GLR处理并在蓝光下处理后的细胞内ROS产生；（j）GLR在P.gingivalis上清液中处理后的降解TEM图像；（k）GLR在含或不含P.gingivalis的PBS中的镓卟啉释放情况

（5）GLR 对 P. gingivalis 的抑制作用

在无光条件下，GLP和GLR对P.gingivalis的抗菌效果分别为18%和40%（图4A）；有光条件下，GLP和GLR的抑制率分别增加30%和80%（图4B），表明GLR比GLP更易被P.gingivalis识别利用，可能因GLR表面暴露的红细胞膜相关蛋白，且镓离子利用影响细菌代谢，卟啉沉积在光照下引发ROS产生致细菌死亡。向经不同材料预处理的P.gingivalis中加入5 mM H₂O₂，GLP和GLR的抑制率分别为22%和50%（图4C），未处理的P.gingivalis能耐受该浓度H₂O₂，单独GLP或GLR抑制率仅18%和40%（图4A），说明GLR处理显著降低P.gingivalis对氧化应激的抵抗力。与单独H₂O₂（8.5%）或GLR（35.6%）相比，GLR与H₂O₂联用抑制效果增强（49.4%）；与单独光照射（Hv，14.8%）或GLR（35.6%）相比，GLR与光照射联用抑制效果显著增强（79.4%）（图4D、4E），证实镓离子引起的代谢紊乱和卟啉产生的ROS协同有效杀死P.gingivalis。计数（图4F）和SEM观察处理后细菌（图4G）显示，GLR与光照射联用能破坏P.gingivalis结构并有效抑制其生长。

图4 P.gingivalis的抗菌效果及生物膜处理结果。（a）PBS、LP、LR、GLP或GLR对P.gingivalis的抗菌效果；（b）在蓝光下PBS、LP、LR、GLP或GLR对P.gingivalis的抗菌效果；（c）在H₂O₂处理下PBS、LP、LR、GLP或GLR对P.gingivalis的抗菌效果；（d）抗菌效果比较和（e）流式分析显示不同条件下GLR对P.gingivalis的抗菌效果；（f）P.gingivalis在不同条件下的数量；（g）SEM图像；（h）人龈下菌斑建立的生物膜在用PBS、LP、LR、GLP或GLR处理并在蓝光下照射后的残留面积；（i）相对定量

（6）GLR 对 P. gingivalis 代谢的扰乱作用

RNA转录组分析显示，吸收镓卟啉的P.gingivalis基因表达显著变化，有832个基因表达上调，815个基因表达下调（图5A）。差异表达基因的基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，GLR处理后，P.gingivalis的碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢、能量代谢以及大分子生物合成过程等生物过程受到影响（图5B、5C），证实GLR顺利获得扰乱代谢抑制P.gingivalis生长。

（7）GLR 减少 P. gingivalis 对上皮细胞的侵袭

图5D显示不同材料处理后P.gingivalis对上皮细胞的粘附或侵袭及氧化应激反应。GLR处理组P.gingivalis对上皮细胞粘附显著减少，其他组仍有粘附或侵袭能力。流式细胞术定量细胞内ROS（图5E、5F）显示，GLR处理组上皮细胞氧化应激显著降低，LR和GLR处理组有一定效果，LR处理组氧化应激水平降低可能因LR与P.gingivalis竞争性结合减少其与上皮细胞接触，GLP处理组中GLP释放的镓卟啉部分抑制P.gingivalis活性。P.gingivalis对上皮细胞的侵袭情况如图5G所示，PBS组和LP处理组观察到大量细菌侵袭，LR和GLP处理组仅少量细菌侵袭，而GLR处理组上皮细胞内细菌侵袭极少，表明GLR策略可与P.gingivalis结合抑制其活性，阻止其与上皮细胞接触和侵袭。

图5 P.gingivalis经GLR处理后的转录组分析及对上皮细胞的影响。（a）RNA测序分析显示P.gingivalis经GLR处理后表达差异显著的基因数量的散点图；（b）KEGG注释分析；（c）GO富集分析显示P.gingivalis经GLR处理后的结果；（d）共聚焦显微镜图像显示不同处理后P.gingivalis对上皮细胞的粘附情况；（e）流式细胞术和（f）定量分析显示不同处理后上皮细胞内ROS的产生情况；（g）电子显微镜图像显示P.gingivalis对上皮细胞的侵袭情况

（8）GLR 抑制大鼠牙周炎的进展

采用∞-结扎法建立大鼠牙周炎模型并接种P.gingivalis（图6A），用PBS、Hv或GLR联合Hv（GLR/Hv）治疗。三维微CT重建（图6B）和统计分析（图6C）显示GLR/Hv治疗有效抑制牙槽骨吸收。牙龈出血指数（GBI）评分（图6D）和炎症因子（IL-6和TNF-α）表达（图6E）均表明GLR/Hv治疗减轻牙龈组织炎症，可能因GLR与P.gingivalis竞争性结合减少其侵袭。荧光原位杂交（FISH）切片实验（图6F）显示GLR组中P.gingivalis侵入牙龈组织数量最少。治疗后大鼠重要器官切片未见明显异常（图S26），血常规检查显示PBS组白细胞和淋巴细胞增多（图6G），而GLR/Hv治疗组血液指标与健康大鼠无显著差异。电感耦合等离子体质谱（ICP）分析显示GLR/Hv组大鼠肝脏和肾脏未检测到镓离子显著积累（图6H），表明GLR策略具体内应用潜力。

（9）GLR 在体内抑制龈下菌斑中的 P. gingivalis

Hv处理降低了龈下菌斑中P.gingivalis的丰度，可能与P.gingivalis所含铁卟啉对蓝光敏感有关。GLR与Hv联合使用几乎完全清除了龈下菌斑中的P.gingivalis（图6I、6J），表明GLR能靶向P.gingivalis并降低其在牙周炎中的数量。

图6 大鼠牙周炎模型的建立及治疗效果评估。（a）顺利获得∞-结扎法建立大鼠牙周炎模型并在结扎区域接种P.gingivalis；（b）大鼠上颌结扎区经治疗后的微CT扫描3D重建；（c）经治疗后牙周骨吸收距离的测量（从牙槽嵴到牙釉质牙骨质界）；（d）经治疗后的牙龈出血指数（GBI）评分；（e）经治疗后牙龈组织中IL-6（绿色）和TNF-α（红色）的表达；（f）用FISH可视化显示P.gingivalis（红色）在牙龈组织中的位置；（g）大鼠经治疗后的血常规检查；（h）顺利获得ICP分析大鼠肝脏或肾脏中残留的镓离子；（i）经治疗后龈下微生物群落中前20个细菌比例的热图；（j）经治疗后龈下微生物群落中P.gingivalis比例的变化情况