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安徽中医药大学郭建团队针对牙周炎的临床治疗局限性，开发了一种负载银纳米颗粒（AgNPs）和槲皮素/咖啡酸苯乙酯脂质复合物（CQ-ML）的智能水凝胶（A/CQ-ML@Gel）。该水凝胶整合了抗菌（AgNPs/壳聚糖）、抗炎（槲皮素调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬以清除ROS）和促骨再生（CAPE增强牙周膜干细胞成骨分化）功能，顺利获得程序化释药和响应性凝胶特性，为牙周炎的综合治疗给予了新的策略和思路。该文章于2025年3月17日以《Chitosan-P407-PNIPAM hydrogel loaded with AgNPs/lipid complex for antibacterial, inflammation regulation and alveolar bone regeneration in periodontitis treatment》为题发表于《International Journal of Biological Macromolecules》（DOI：10.1016/j.ijbiomac.2025.142080)。

A/CQ-ML@Gel对牙周炎进行三模式治疗的示意图

（1）CQ-ML和AgNP的制备和表征

CQ-ML的粒径为144.5 ± 0.40 nm，zeta电位为-45.4 ± 0.36 mV，与CAPE-L相近，表明其外层由脂质膜包裹（图1A）。透射电镜结果显示，Qu-MEs呈透明球形，粒径约30 nm（图1B），CQ-ML为“小包大”结构，与文献报道一致。荧光共振能量转移（FRET）实验表明，DiO/DiI-ML的FRET比率显著高于DiI + DiO混合物（P < 0.0001），表明外层脂质膜与内部微乳间距<10 nm（图1C）。CQ-ML对槲皮素和咖啡酸苯乙酯的包封率分别为93.47 ± 0.06%和90.98 ± 0.94%。AgNPs粒径为45.48 ± 0.208 nm（制备方法未提及）。A/CQ-ML@Gel在37 ℃下表现出快速且稳定的温度敏感性液-固相转变（图1D）。扫描电镜（SEM）显示A/CQ-ML@Gel和CS-P407-PNIPAM内部结构为不规则网状，孔径约200 μm，可实现药物持续释放（图1E）。流变学测试表明，CS-P407-PNIPAM在37 ℃时粘度最高（图1F），高粘度有利于药物在牙周袋内滞留和缓慢释放。A/CQ-ML@Gel保持与CS-P407-PNIPAM相似的剪切稀化性质（图1G），注射时流动性好。储能模量和损耗模量随温度升高而增加，G′始终高于G″，表明A/CQ-ML@Gel可抵抗牙周袋外力（图1H、图1I）。CQ-ML呈程序性释放特征，Qu先释放，CAPE后释放，而在A/CQ-ML@Gel中释放顺序相反（图1J）。A/CQ-ML@Gel具有pH敏感性降解性能，在pH 3.6时溶解度>90%，在pH 7.4时溶解度仅为8.03 ± 1.44%（图1K）。

图1 CQ-ML和A/CQ-ML@Gel的表征。（a）Qu-ME、CAPE-L和CQ-ML的粒度分布；（b）Qu-ME、CAPE-L和CQ-ML的TEM图像；（c）DiI + DiO和DiI/DiO-ML的FRET效应；（d）25℃和37℃下A/CQ-ML@Gel的外观；（e）CS-P407、CS-P407-PNIPAM和A/CQ-ML@Gel的SEM图像；（f）37℃下PNIPAM、CS-P407、CS-P407-PNIPAM的粘度（剪切速率为0.1至100 1/s）；（g）剪切速率为0.1~100 1/s时，A/CQ-ML@Gel的粘度随剪切速率的变化；（h）37℃下CS-P407-PNIPAM和CS-P407的储存模量和损耗模量（G′和G″）随温度变化；（i）37℃下A/CQ-ML@Gel的储存模量和损耗模量（G′和G″）随温度变化；（j）Qu和CAPE从CQ-ML或A/CQ-ML@Gel中的体外释放曲线；（k）A/CQ-ML@Gel在pH 7.4和pH 3.6条件下的质量残留率。数据以平均值±SD表示，n=8

（2）A/CQ-ML@凝胶的体外抗菌作用

A/CQ-ML@Gel对牙周炎关键病原体P.g具有体外抗菌作用。扫描电镜观察显示，对照组P.g表面光滑、形态规则，而AgNP组P.g膜出现明显缺陷和形态变化（图2A）。CS-P407-PNIPAM组也观察到类似的细菌膜破坏，归因于壳聚糖的抗菌特性。A/CQ-ML@Gel组中P.g膜缺陷和形态破坏最为显著，表明其整合了AgNP和壳聚糖的抗菌作用（图2B）。吸光度检测结果表明，AgNPs、CS-P407-PNIPAM和A/CQ-ML@Gel组的悬液吸光度值均显著低于对照组，说明A/CQ-ML@Gel中的AgNPs和CS-P407-PNIPAM组分可抑制P.g增殖。活/死染色结果表明，Qu-MEs、CAPE-L和CQ-ML对大肠杆菌无明显抑菌作用，但A/CQ-ML@Gel处理的P.g大部分死亡（图2C）。

图2 A/CQ-ML@Gel的体外抗菌作用。（a）扫描电镜观察P.g形态特征，白色箭头示细菌膜缺陷；（b）不同实验组治疗后P.g的吸光度值，数据为平均值±SD，n=8，*P<0.0001；（c）不同实验组治疗后P.g的活/死染色

（3）巨噬细胞摄取和巨噬细胞表型重塑

使用C6荧光标记物标记纳米颗粒以评估细胞摄取。C6、C6-ME、C6-L和C6-ML与RAW264.7细胞共孵育2小时后，荧光显微镜观察显示，C6-ML和C6-L处理的细胞绿色荧光显著，C6-ML的细胞摄取与脂质体相似（图3A）。流式细胞术定量结果表明，巨噬细胞对C6-ML的摄取显著高于其他组（图3B）。Qu和CAPE在25 μM浓度下无明显细胞毒性，且CQ-ML对RAW264.7细胞无显著细胞毒性（图3C）。顺利获得流式细胞术检测CD86（M1型标记物）和CD206（M2型标记物），以评估巨噬细胞表型。LPS诱导的RAW264.7细胞模型中，Qu-MEs处理的巨噬细胞CD206/CD86比值高于CAPE-L处理的巨噬细胞，表明Qu-MEs对M2表型的调节作用更强（图3D）。

图3 巨噬细胞摄取和表型极化研究。（a）C6、C6-ME、C6-L和C6-ML组细胞内绿色荧光；（b）流式细胞术定量经C6、C6-ME、C6-L和C6-ML处理的巨噬细胞荧光，数据为平均值±标准差，n=3，**P<0.01，*P<0.0001；（c）不同浓度Qu或CAPE的细胞活力，以及CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-ME、CQ-ML处理的RAW264.7细胞（CAPE：25 μM，Qu：4 μM）的细胞活力，数据为平均值±SD，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（d）流式细胞仪检测不同处理巨噬细胞散点图

（4）CQ-ML调节PINK 1/Parkin-ROS级联反应抑制炎症

CQ-ML对巨噬细胞炎症因子的抑制作用可能与PINK1/Parkin-ROS信号通路有关。实验结果显示，与含槲皮素的制剂相比，CAPE-L处理组PINK1和Parkin表达水平较低，而CQ-ML处理显著增加PINK1和Parkin表达，启动线粒体自噬（图4A-D）。免疫荧光和流式细胞术检测表明，LPS诱导的RAW264.7细胞中，CQ-ML表现出最强的ROS生成抑制能力，这归因于槲皮素促进线粒体自噬及脂质复合物的高细胞摄取率（图4E-G）。这些结果表明，CQ-ML顺利获得调控PINK1/Parkin-ROS级联，发挥以槲皮素为主导的线粒体自噬作用，从而抑制炎症。

图4 CQ-ML调节巨噬细胞中PINK1/Parkin-ROS级联反应。（a）免疫荧光检测各组线粒体形态及PINK1和Parkin共定位；（b）ImageJ绘制各组PINK1和Parkin的3D表面图；（c，d）ImageJ定量PINK1和Parkin相对荧光强度，数据为平均值±SD，n=8，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.0001；（e）各组巨噬细胞中DCFH-DA荧光表达；（f）ImageJ定量各组相对DCFH-DA荧光强度，数据为平均值±SD，n=8，*P<0.05，*P<0.0001；（g）流式细胞术定量各组处理的巨噬细胞中DCFH-DA荧光强度，数据为平均值±SD，n=8，*P<0.0001

（5）CQ-ML促进牙周膜干细胞的成骨分化（体外研究）

 CQ-ML对牙周膜干细胞（PDLSCs）成骨分化能力的调控作用研究结果显示，槲皮素（Qu）和咖啡酸苯乙酯（CAPE）浓度低于25 μM时对PDLSCs无明显细胞毒性（图5A），CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-MEs和CQ-ML处理组（CAPE：25 μM，Qu：4 μM）也未观察到显著毒性。碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色结果显示，正常对照组经成骨诱导培养基刺激后ALP阳性染色区域和矿化结节形成明显，而LPS处理的模型组较弱。CQ-ML和CAPE-L处理组均显示出显著的ALP阳性染色区域和矿化结节形成（图5B-C）。定量分析表明，CQ-ML和CAPE-L处理组的ALP浓度分别是模型组的1.70倍和1.48倍（图5D-E）。

图5 CQ-ML促进PDLSCs体外成骨分化。（a）不同浓度Qu或CAPE的细胞活力，以及CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-ME、CQ-ML处理的PDLSCs细胞活力，数据为平均值±SD，*P<0.001，*P<0.0001；（b）各制剂处理的PDLSCs的ALP和茜素红染色；（c，d）各制剂处理的PDLSCs中ALP或茜素红的相对面积，数据为平均值±SD，顺利获得ImageJ定量，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（e）各制剂处理的PDLSCs上清液中ALP浓度，数据为平均值±SD，n=8，**P<0.01，*P<0.001

（6）A/CQ-ML@Gel在体治疗牙周炎的效果及生物安全性评估

顺利获得丝线结扎联合LPS注射法建立SD大鼠牙周炎模型（图6A）。4周治疗后，A/CQ-ML@Gel组牙龈出血消失，牙龈组织再生（图6B-C），牙周袋深度（PD）显著降低，效果与阳性对照药派丽奥相当（图6D-E）。H&E染色显示模型组牙龈乳头破坏、牙周韧带结构紊乱，而治疗组组织再生良好（图6F）。Masson染色证实A/CQ-ML@Gel组胶原表达最高（图6G）。

图6 A/CQ-ML@Gel对牙周炎的体内治疗作用。（a）牙周炎模型建立及给药示意图；（b-e）各组治疗后2周、4周GI或PD值，数据为平均值±标准差，n=6，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（f）各组牙周组织H&E染色，（g）Masson染色，AB为牙槽骨，PDL为牙周膜

（7）A/CQ-ML@Gel顺利获得调控PINK1/Parkin通路抑制牙周炎症体内研究

A/CQ-ML@Gel的体内抗炎作用机制得到验证。免疫荧光检测显示（图7A-D），模型组因长期氧化应激导致PINK1/Parkin表达降低，而A/CQ-ML@Gel治疗4周后显著提升PINK1/Parkin表达，效果优于单独使用Qu-MEs@Gel或CAPE-L@Gel。免疫组化结果显示（图7E-G），促炎因子IL-6显著减少，抗炎因子IL-10增加2.3倍。这证实了A/CQ-ML@Gel顺利获得ROS-PINK1/Parkin通路促进巨噬细胞向M2型极化。在pDA-mBP@DAT和LIPUS刺激下，膜内成骨和软骨内成骨均参与了骨修复过程（图7G）。

图7 A/CQ-ML@Gel促进PINK1/Parkin表达用于体内抗炎。（a，b）治疗后牙周组织中PINK1和Parkin的表达；（c-d）PINK1和Parkin在各制剂处理的牙周组织中的相对强度，数据为平均值±SD，使用ImageJ软件定量，*P<0.001，*P<0.0001；（e）治疗后牙周组织中IL-6和IL-10的免疫组化染色；（f-g）使用ImageJ定量各组牙周组织中IL-6和IL-10的相对强度，数据为平均值±SD，n=3，**P<0.01，*P<0.0001。AB为牙槽骨，PDL为牙周膜

（8）A/CQ-ML@Gel促进牙槽骨再生

A/CQ-ML@Gel在体内促进牙槽骨再生的作用得到研究。Micro-CT结果显示（图8A），模型组上颌第一和第二磨牙的黄色间隙大于正常组，表明牙槽骨破坏明显。A/CQ-ML@Gel和CAPE-L@Gel施用后黄色间隙变小，表明显著的牙槽骨再生，而Qu-MEs@Gel的修复作用较弱。进一步研究牙周组织中成骨标志物OP.G和OPN的表达（图8B），模型组OP.G、OPN表达减少，而A/CQ-ML@Gel可逆转上述变化（图8C-D）。RANKL-RANK信号诱导破骨细胞活化，加速牙槽骨破坏，而骨桥蛋白的高表达表明骨髓源性基质细胞沿成骨途径分化，与无胶原骨水泥层的形成相关，有利于骨生长。

图8 A/CQ-ML@Gel促进牙槽骨再生的体内实验研究。（a）治疗后各组大鼠上颌骨显微CT图像；（b）免疫组化染色观察不同制剂对大鼠牙周组织中OP.G和OPN的影响；（c-d）使用ImageJ定量各制剂处理的大鼠牙周组织中OP.G和OPN的相对强度，数据为平均值±SD，n=3，*P<0.001，*P<0.0001。AB为牙槽骨，PDL为牙周韧带